CPSF4 Proteininin Üçlü Negatif Meme Kanseri Metastazındaki Rolü

Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) oldukça agresif klinik davranışa ve heterojeniteye sahip bir meme kanseri alttipidir. TNBC’ye bağlı ölümlerin önde gelen nedeni olan metastazların mekanizması anlaşılamamıştır. TNBC'de PIK3CA, TP53 ve PTEN’in dışında tanımlanmış bazı tekrarlayan mutasyonların, TNBC fenotipinin onkogenlerin aberan expresyonu gibi genetik olmayan değişimleri ile ortaya çıktığını düşündürmektedir. Bu çalışmada, CPSF4’ün TNBC metastazı ve altta yatan mekanizmasındaki potansiyel rolü araştırılmıştır.

GenExMiner ve Kanser Genom Atlas’ı (KGA) kullanarak, CPSF4’ün klinik önemi analiz edildi. CPSF4’ün artırılmış mRNA düzeyleri, meme kanseri hastalarında daha kısa genel sağkalım ile ilgili idi ve CPSF4 proteini bazal-benzeri meme kanserinde normal meme dokusuna ve diğer meme kanseri türlerine göre daha yüksekti. Bununla uyumlu olarak, TCGA verisi de CPSF4 mRNA düzeyinin bazal benzeri ve HR+ meme kanserlerinin normal meme kanserinden daha yüksek olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar CPSF4'ün TNBC’de kritik bir rolü olabileceğini işaret etmektedir. CPSF4 proteininin meme kanserinde normal meme dokusuna göre daha yüksek olduğu ve TNBC hücre ifadesinin diğer alt tiplere göre daha yüksek olduğu saptandı.

MDAMB-231 ve SUM-159PT TNBC hücre serilerinde deneyler yapıldı. CPSF4’ün ifadesini baskılamak için küçük interferans RNA/kısa saç tokası RNA ile transfekte edildikten sonra transwell göçü ve matrijel invazyon tahlileri yapıldı. CPSF4 gen ifadesinin baskılanması hücre istilası ve göç kapasitesini azalttı. Tersine lentiviral vektör-yönlendirmeli CPSF4 artmış gen ifadesi ile hücrelerde yapılan transwell göç ve matrijel istila tahlilleri, CPSF4 ifade artışının her iki hücre serisinde de istila ve göçü anlamlı biçimde artırdığını gösterdi. CPFS4’ün metastaza en önemli adımlardan olan epiteliyal-mezenşimal geçişi (EMG) indükleyip indüklemediğini belirlemek için CPFS4 proteinindeki değişikliklere karşı Snail, ZEB1 ve vimentin ifadeleri araştırıldı. CPFS4’ün artan gen ifadesinden sonra EMG-bağlı belirteçleri artarken, CPFS4 gen ifadesinin baskılanmasının EMG’yi inhibe ettiğini gösteren sonuçlar CPFS4’ün EMG’yi indükleyerek TNBC hücre metastazını kolaylaştırdığını kanıtladı. Ayrıca TNBC hücrelerinde CPFS4 gen ifadesi baskılanması nedeniyle hücre proliferasyonunun da gerilediği gözlemlendi.

162 aday genden 65'inin promotor bölgeleri ile korelasyon gösterdiği saptanan CPFS4 hedef genlerini ayırt etmek için kromatin immünopresipitasyon (KrİP)-sekanslama uygulandı. Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KGGA) yolak analizi hedef genlerin genom nükleotid-eksizyon onarımı, epidermel büyüme faktör reseptör sinyallemesi ve metastaz ile ilgili olduğunu ortaya çıkardı. Kantitatif ters transkripsiyon PCR (kTT) ile metastaza-bağlı genlerin ekspresyonu incelendiğinde; CPFS4’ün gen ifadesi baskılandığında, bir P53 baskılayıcısı olan Mouse double minute 4 (MDM4) ekspresyonunun belirgin biçimde azaldığı keşfedildi. Böylece MDM4 gen promotorunda CPSF4'ün bağlanmasını KrİP kantitatif PCR ile teyit edildi. Ayrıca MDM+ promotorun tam boyunu veya farklı delesyon parçalarını içeren MDM4 promotor tarafından düzenlenen lusiferaz reporter plazmidleri yapılandırıldı. +178 ~ +215 bölgesi MDM4 transkripsiyon aktivasyonu için şarttı ve +178 ~ +187 bölgesi CPSF4-bağımlı transkripsiyon için vazgeçilmezken, +188 ~ +197 bölgesi promotor aktivitesi için esas elemanları içermekteydi. Western blot testi de CPSF4’ün MDM4’ün ekspresyonunu artırdığını gösterdi. Bu nedenle, CPSF4'ün, tam uzunluktaki transkriptin ekson 6'sından yoksun ve çoğalan hücrede bol miktarda bulunan varyantı MDM4-S'nin alternatif eklenmesinde çalışıp çalışmadığını belirlemek için qRT-PCR uygulandı. MDM4-S seviyesi, değişen CPSF4 ekspresyonuna rağmen etkilenmedi. Ayrıca, MDM4 mRNA ve proteinin stabilitesi test edildi ve CPSF4'ün bunun üzerinde hiçbir etkisi olmadığı görüldü. Ayrıca, CPSF4'ün ne ekspresyonunun baskılanması ne de aşırı ekspresyonu, MDM4'ün etkileşim ortakları olan p53 ve MDM2’nin ekspresyonunu etkilemedi. Bu bulgular hep beraber, CPSF4'ün MDM4'ün ekspresyonunun transkripsiyonel olarak düzenlediğini göstermektedir. Ayrıca, CPSF4'ün MDM4 aracılığıyla TNBC hücrelerinin metastazını destekleyip desteklemediğini belirlemek için, kurtarma çalışmaları gerçekleştirildi. İn vivo metastatik model oluşturmak için 4 haftalık tüysüz farelerin kuyruk damarına TNBC hücreleri enjekte edildi ve 12 hafta sonra, akciğerleri çıkarıldı ve metastatik nodüller sayıldı. CPSF4'ün gen ekspresyonunun baskılanması, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında metastatik nodüllerin sayısını ve boyutunu azaltırken, MDM4’ün aşırı ekspresyonu bu etkileri tersine çevirdi. İmmünohistokimyasal (IHC) boyama, CPSF4 geninin susturulmasından sonra vimentin ve ZEB1 ifadesinin azaldığını gösterdi ve bu etkiler, MDM4'ün aşırı ekspresyonu ile ortadan kaldırıldı. Bu bulgular, CPSF4'ün kısmen MDM4 yoluyla TNBC hücre metastazını düzenlediğini göstermektedir.

Son olarak, CPSF4 ve MDM4 ekspresyonu ve meme kanseri arasındaki ilişkiyi netleştirmek için 101 TNBC olmayan ve 28 TNBC hasta dahil olmak üzere, 129 meme kanseri hastasında İHC boyama kullanıldı. Kaplan-Meier analizi, yüksek CPSF4 ekspresyonunun hem TNBC'de (P=0.3960) hem de genel meme kanseri hastalarında (P=0.0343) zayıf genel sağkalım ile korele olduğunu gösterdi, ancak küçük örneklem boyutu nedeniyle korelasyon TNBC grubunda istatistiksel olarak anlamlı değildi. Ayrıca Kaplan-Meier analizi, yüksek CPSF4-MDM4 seviyesinin TNBC ve genel meme kanseri popülasyonlarında daha kötü genel sağkalım ile ilişkili olduğunu gösterdi. (TNBC'de P=0.0218, genel meme kanserinde P=0.0316) Ek olarak, çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler regresyon analizi, CPSF4-MDM4 seviyesinin bağımsız bir tanısal faktör olduğunu göstermiştir. Ayrıca, sağkalımı tahmin etme doğruluğunu değerlendirmek için konkordans indeksi(K-endeksi) hesaplandı. Sonuç, CPSF4-MDM4 seviyesini (0,833, %95 güven aralığı (%95 GA) = 0,647–1,02) içeren modeldeki genel sağkalımın tahmini için C-endeksinin, CPSF4-MDM4 seviyesini dışlayandan (0,726, %95) daha yüksek olduğunu gösterdi. (CI=0.504-0.948) Korelasyon analizi, MDM4 ekspresyonunun, CPSF4 ekspresyonu ile pozitif olarak ilişkili olduğunu gösterdi (korelasyon katsayısı =0.302, P=0.001)

Bilindiği kadarıyla, bu CPSF4'ün MDM4'ün gen ekspresyonunu artırarak ve EMT'yi indükleyerek TNBC metastazını desteklediğini gösteren ilk çalışmadır. Mekanik olarak, MDM4’ün CPSF4’ü alternatif ekleme, mRNA veya protein stabilitesini değil, transkripsiyonel olarak düzenlediği keşfedildi. Bulgular ayrıca CPSF4-MDM4 düzeyi yüksek olan hastaların TNBC'de daha kötü prognozla ilişkili olduğunu ortaya koydu ve bu da onları TNBC'nin potansiyel tanısal biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri haline getirmektedir.