Spinal Musküler Atrofinin Saptanmasında Geliştirilen Yeni Teknoloji

Spinal musküler atrofi (SMA), omurilikte ve beyin sapında motor nöronların kaybından kaynaklanan ve hipotoniye, proksimal kas zayıflığına ve solunum yetmezliğine yol açan en yaygın otozomal resesif nörodejeneratif hastalıktır. Yapılan araştırmalar SMA’nın, 7.000 canlı doğumda yaklaşık 1 oranında bildirilen bir insidansa ve %1.38 ile %2.13 arasında değişen yüksek bir taşıyıcı oranına sahip olduğunu göstermiştir. Bu şiddetli nöromüsküler hastalık, American College of Medical Genetics tarafından genel popülasyonda rutin taşıyıcı taraması için önerilmiştir.

SMA hastalarının yaklaşık %95'i kromozom 5q13 üzerinde yer alan survival motor nöron 1 (SMN1) geninin ekson 7 veya ekson 7 ve 8'in her ikisinin homozigot yokluğunu göstermektedir. Bu bölge hemen hemen aynı iki kopya içermekle birlikte telomerik kopya (SMN1 geni) ve sentromerik kopya (SMN2 geni), SMN1 ekson 7 kopya numarasını tespit ederek SMA'nın moleküler tanısının zorluğunu arttırmaktadır. SMN1 geni, SMN2 geninden, dördü kodlamayan bölgede ve biri kodlama bölgesinde (ekson 7) olmak üzere yalnızca beş tek nükleotit ile farklılık göstermektedir. Araştırmacılar tek kodlama bölgesi varyantının, ekson 7'de SMN1 ve SMN2 arasında tek bir C'den T'ye sübstitüsyonun, tam uzunluktaki SMN2 transkriptlerinde bir azalmaya neden olduğunu ve SMN1'i SMN2'den esas olarak ayırt ettiğinin düşünüldüğünü belirtmişlerdir. Bu nedenle araştırmacılar, SMN1 tespitinin gerçek zamanlı bir PCR yaklaşımını daha da optimize etmek için, geleneksel primerleri ve probları kilitli nükleik asitlerle (LNA) modifiye ettiklerini ve klinik örnekleri kullanarak test performansını doğruladıklarını belirtmişlerdir. Ayrıca araştırmacılar kurutulmuş kan lekeleri (DBS) kullanan yenidoğanlarda SMA taraması için bu yeni teknolojinin uygulamasını da genişlettiklerini ifade etmişlerdir.

SMA hastalarını ve taşıyıcılarını tespit etmek

Yapılan bu çalışma bilindiği kadarıyla, SMN1 ekson 7'nin kopya sayısını belirlemek için LNA ile modifiye edilmiş primerler kullanılarak geliştirilen ilk çift yönlü gerçek zamanlı PCR yaklaşımıdır. Çalışmada 3'uçları SMN1'e özgü yerleri hedefleyen LNA ile modifiye edilmiş bir primer çifti c .835-44g ve c.840C tasarlanmış ve özgüllüğü gerçek zamanlı PCR ve Sanger Sıralaması ile incelenmiştir. SMN1 ve kontrol geni albümini (ALB) amplifiye etmek için çift yönlü gerçek zamanlı bir PCR yaklaşımı geliştirilmiştir. Dubleks yaklaşımın klinik etkinliğini değerlendirmek için 97 taze periferik kan örneği ve 25 kurutulmuş kan lekesi ile randomize çift kör bir çalışma yürütülmüş olup bu yeni yaklaşım daha sonra 753 yenidoğan DBS'yi taramak için kullanılmıştır. Araştırmacılar LNA ile modifiye edilmiş primerlerin, geleneksel primerler ile karşılaştırıldığında SMN1 amplifikasyonu için gelişmiş spesifıklik ve %6.8 daha yüksek verimlilik sergilediğini belirtmişlerdir. Araştırmacılar çift yönlü gerçek zamanlı PCR yaklaşımını optimize ederek SMN1 testini stabilize ettikten sonra, bir klinik çalışmanın SMA hastalarını ve taşıyıcılarını tespit etmek için yeni yaklaşımlarının duyarlılığının ve özgüllüğünün %100 olduğunu doğruladığını bildirmişlerdir. Çalışmada bu yeni yaklaşımı kullanılarak, taranan 753 yenidoğanın 15'inin DBS aracılığıyla taşıyıcı olarak belirlendiği, geri kalanı ise normal bireyler olarak belirlendiği gözlemlenmiştir. Bu veriler, Güney Orta Çin'in Hunan eyaletinde %1.99 taşıyıcı oranını ortaya koymaktadır.

Sonuç olarak araştırmacılar, SMN1 ekson 7'nin kopya sayısını tespit etmek için LNA ile modifiye edilmiş primerler kullanarak çift yönlü bir gerçek zamanlı PCR yaklaşımı geliştirdiklerini belirtmişlerdir. Araştırmacılar ayrıca bu yaklaşımın, DBS gibi eser DNA örnekleri ile yenidoğan taraması ve periferik kan DNA'sı kullanılarak hamile kadınların taşıyıcı taraması için uygun olduğunu ifade etmişlerdir.