Spinal Musküler Atrofide Yaygın Olarak Kullanılan İki Genetik Tarama Yöntemi

Spinal musküler atrofi (SMA), omuriliğin ön boynuzundaki motor nöronların kaybına neden olan, hayatta kalma motor nöron 1 (Survival Motor Neuron - SMN1) proteininin eksikliğinden kaynaklanan otozomal resesif bir hastalık olmakla birlikte genetik olarak benzer bir gen olan SMN2, alternatif birleştirme yoluyla yalnızca %10'luk doğru şekilde eklenmiş tam uzunlukta ve işlevsel SMN proteinine neden olan 7. eksonunda Konum 6'da çeviri açısından sessiz bir C'den T'ye geçişe sahiptir. Ancak SMA'dan etkilenen bireylerde SMN2, SMN proteininin tek kaynağıdır ve kopya sayısı ile hastalığın ciddiyeti arasındaki ilişki nedeniyle hastalığı değiştiren bir gen olarak tanımlanmış olup, DNA örneklerinde SMN1 ve SMN2 kopya sayılarını ölçmek için çok sayıda tahlil ortaya çıkarılmıştır. Araştırmacılar şu anda, multipleks ligasyona bağımlı prob amplifikasyonu (MLPA) ve yeni ortaya çıkan damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) yönteminin, yaygın olarak kullanılan iki genetik tarama yöntemi olduğunu belirtmişlerdir. Bu nedenle araştırmacılar, SMN1 ve SMN2'nin kopya sayılarını değerlendirmek için iki farklı teknolojinin tekrarlanabilirliğinin karşılaştırıldığını ve bir klinik çalışmadan yirmi dört hastanın toplandığını bildirmişlerdir. Yapılan çalışmada Coriell Hücre Depolarından (sırasıyla i-1, i-2 ve i-3) 2 veya 3 SMN2 kopyalı SMA tip I ve 3 SMN2 kopyalı SMA tip II insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) elde edilmiş olup tüm ailelerden bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Çalışma, Fujian Tıp Üniversitesi'nin İlk Bağlı Hastanesinin Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Araştırmacılar SMN1 kopya numaraları için yedi MLPA sonucu örneği ve SMN2 kopya numaraları için on dokuz örnekte belirli bir kopya numarasına atanamadığını, çünkü oranların kit talimatı tarafından tanımlanan belirsiz bir aralık içinde yer aldığını veya iki testte tutarlı olmadığını belirtmişlerdir.

ddPCR'den elde edilen SMN1 ve SMN2 kopya sayıları

Yapılan MLPA testi, SMN1 kopya numaralarının yineleme oranının %74,1 ve SMN2'nin %29,6 olduğunu göstermiştir. Araştırmacılar 4'ten fazla SMN kopyası için güvenilir bir sonuç elde etmenin çok zor olduğunu, çünkü MLPA’nın, 2,15'in altında bir oranla SMN'nin sadece 4'ten az veya eşit kopyasını değerlendirdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca çalışmada i-1 için MLPA SMN2 kopya sayısı sonuçlarının Test 1'de 2, Test 2'de 3, i-2 için bu iki testte 4'ün üzerinde ve i-3 de bu iki testte 4'ün üzerinde çıkmış olup daha önce gösterildiği gibi Coriell Hücre Depoları ile tutarlı olmadığı gözlemlenmiştir. Toplu olarak, bu sonuçlar, yalnızca oran aralığı içinde kopya sayısı değerlerini elde edebileceğini ve MLPA için kopya sayısı 4'ü aşan örnekleri tespit edemediğini göstermiştir. ddPCR sonuçları analiz edilirken, SMN1 ve SMN2 kopya numaralarının yineleme oranlarının ddPCR için %100 olduğu bulunmuş olup bunlara ek olarak, ddPCR'den elde edilen SMN1 ve SMN2 kopya sayıları klinik fenotiplerle uyumlu olduğu gözlemlenmiştir. Ayrıca, 3 iPSC için ddPCR'nin SMN2 kopyası sonuçlarının Coriell Hücre Depolarınınkilerle aynı olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar birlikte ele alındığında, ddPCR’nin yorumlama için bir dozaj oranı kullanılırken, MLPA tarafından erişilemeyen bir özgüllük düzeyi, yorumlama aralığı ve MLPA sonuçları için maksimum oran aralığı sağladığını belirtmişlerdir. Genel olarak, MLPA ve ddPCR yöntemlerini karşılaştırarak, ddPCR, fenotip-genotip korelasyonunun yanı sıra bu hastalığın tedavisi için açıklama sağlamak üzere SMN1 ve SMN2 kopya sayılarının analizi için sağlam bir platform olarak tanımlanmış olup, bunlara ek olarak SMN1 bileşiği heterozigot mutasyonunun birden fazla yöntemin ortak analizine ihtiyaç duyması önerilmiştir.